Лада-Олександра Антомонова

 

Давайте пригадаємо, що таке CRISPR і чому про нього потрібно знати. Про нього потрібно знати тому, що технології геномного редагування от­от полізуть з усіх шпарин. Відредагувати рослину, зробивши її такою, як вам треба, буде не складніше, ніж обрати сало на базарі.

Загалом технологія CRISPR є результатом одвічної боротьби. Боротьби між бактеріями та їхніми паразитами. Усі напрями технології об’єднує те, що вони є системами адаптивного імунітету. Адаптивність у цьому разі означає, що система може захопити фрагмент генетичної інформації паразита (це може бути не лише вірус, а і плазміда, й інший мобільний генетичний елемент) і вбудувати його у CRISPR­касету, яка є частиною геному бактерії. Такий набутий фрагмент працюватиме, як молекулярна пам’ять, що дає змогу нащадкам бактерії визначати й знешкоджувати паразитів, котрі «врізалися у пам’ять».

 

Кінець ферментної монополії

У розвитку інструментів технології CRISPR-Cas9 мала абсолютну першість і була улюбленицею вчених цілих п’ять років. Проте монархії у біоінженерному королівстві настав кінець, позаяк з’явилася простолюдинка Cas12 (як її називають у Сполучених Штатах Америки), або Cpf1 (як її заведено називати в Європі). CRISPR-Cas12 є іншим ферментом, який, на думку вчених Техаського університету в Остіні, є наразі найефективнішим і найпередбачуванішим. Різноманітні CRISPR-системи існують у природі, вони допомагають бактеріям розпізнавати й боротися з вірусними інфекціями. За дальшого вивчення виявилося, що цих систем, як кучерів на голові Менделя – сила-силенна!

Загальний природний принцип роботи ферментів один – різати ворожу ДНК, а вчені намагаються скористатися цим механізмом для власних потреб, аби мати змогу різати будь-яку ДНК, однак у потрібному місці.

На жаль, жоден з ензимів не ідеальний, навіть Cas9, який вчені застосовували найактивніше. За статистикою, лише 15 % ферментів Cas9 робили те, що від нього очікували. Дослідники потребували хірургічної точності, надто коли заходилося про використання технології у медичних цілях.

«На нинішньому етапі розвитку біоінженерії наша мета полягає в тому, аби знайти найліпший спосіб, який природа дала нам, і зробити його ще кращим, а не просто першим, який випадково потрапив до нас», – говорить доцент кафедри молекулярної біології Університету в Остіні Ілля Фінкельштейн. Він входив до групи дослідників, які виявляли різницю між Cas9 і Cas12.

Деякі експерименти засвідчили, що Cas12 примхливіша, ніж Cas9, але ці дослідження були непереконливими. Наукові сумніви взялися розвіяти вчені з Університету в Остіні. Насправді виявилося, що система Cas12 не лише точніша, а й простіша у використанні, ніж її попередниця. Річ у тім, що для виконання «завдання» з вирізання частини ланцюжка їй потрібна лише комплементарна РНК, тоді як Cas9 потрібна була ще й транспортна РНК. Крім того, Cas12 менша, а отже, зможе діяти там, куди Cas9 не могла потрапити. Результатами досліджень стала стаття у журналі Molecular Cell, який біоінженери люблять так само палко, як аграрії журнал «ЗЕРНО». У цій статті було написано, що механізм Cas12 має велике майбутнє.

 

Тепер пояснюю на пальцях

Тепер пояснюю на пальцях

По суті, команда Університету в Остіні встановила, що Cas12 з’єднується з потрібною ділянкою ДНК, як липучка, тоді як Cas9 приєднувався, як суперклей. Кожен фермент містить фрагмент запису генетичного коду вірусу. Коли він стикається з ДНК, фермент легко приєднується до нього, утворюючи пару нуклеотидів.

Система Cas12 схожа на петлю, що ковзає. Вона немовби сканує кожен нуклеотид на своєму шляху, не прилипаючи до певної послідовності. Як це було з Cas9. Для того аби просканувати РНК, не потрібно її руйнувати. Відтак стає імовірнішою ситуація, коли фермент редагуватиме потрібну частину геному.

«Це робить процес формування базової пари зворотнішим, – каже Рік Рассел, професор молекулярної біології та автор поточного дослідження. – Інакше кажучи, Cas12 робить ретельнішу перевірку кожної пари нуклеотидів перед переходом до дальшої. Після 7‑8‑ми літер послідовності Cas9 переставав перевіряти, а Cas12 охоплює 18 літер і навіть більше.

У вчених виникло запитання: якщо Cas9 чи Cas12 має касету, де записано, який вірус потрібно знищити, чому вона насамперед не знищує себе? Виявилося, що відбувається це завдяки механізму РАМ (protospacer adjacent motive – «мотив, що прилягає до протоспайсеру»). Працює він так: білку-ефектору, для того щоб різати ДНК, не достатньо повного збігу напрямної РНК із мішенню. Потрібно виконати ще одну умову: до мішені має додаватися особлива коротка послідовність, яка засвідчує, що це не його власний геном. У геномній касеті білка-ефектора поруч зі спайсером перебуває повтор, який білок-ефектор розпізнає як власний.

Дослідники погоджуються з тим, що технологія ще й досі не ідеальна, вони вже бачать, в який спосіб можна поліпшити технологію, але ці дослідження подають надію, позаяк у найближчому майбутньому ми отримаємо‑таки «скальпель із лазерним прицілом», який не припускатиметься помилок.

«Наші дослідження свідчать, що Cas12 правильно розпізнає мішень більше як у половині випадків, – підсумовує доктор Фінкельштейн. – Ми бачимо потребу в наших дослідженнях, що надихає працювати з технологією і надалі».

 

Хто першим встав – того й CRISPR

Наприкінці осені хімічний концерн BASF уклав ліцензовану угоду з біомедичним і геномним дослідним центром, що було створено за підтримки Массачусетського і Гарвардського університетів. Тепер на озброєнні концерну з’явився ще один високоточний біоінструмент CRISPR-Cpf1 для поліпшення сільськогосподарських продуктів і хімічних препаратів.

Про технологію CRISPR-Cas9 не чув хіба що глухий, але експерти в галузі біотехнологій закликають звернути увагу на новацію, позаяк CRISPR-Cpf1 – це снайперська гвинтівка порівняно з гарматами, які використовувало османське військо під час облоги Константинополя 1453 року. BASF менше з тим вестиме випробування обох технологій паралельно, що в комплексі має прискорити розробку нових продуктів генної інженерії.

Президент BASF Bioscience Research Пітер Екес говорить про те, що інструменти редагування геному є дальшим кроком у галузі інновацій молекулярної біології. Додавання CRISPR-Cpf1 відчутно розширить технологічні можливості у сучасному сільському господарстві та промисловому рослинництві. Пітер Екес покладає великі сподівання на освоєння нової технології.

«Ця технологія є видозміненим застосуванням редагування геному для дослідницької спільноти. CRISPR-Cpf1 може напряму при­нести користь передовим дослідженням не лише в рослинництві та засобах захисту, а й у медицині. Ми пишаємося тим, що маємо можливість співпрацювати з зацікавленими сторонами в рамках біомедичної і промислової спільноти», – відзначив головний бізнес-директор Broad Institute Іссі Розен.

Monsanto також ґрунтовніше взялася за технологію CRISPR. Компанія співпрацює з американським стартапом Pairwise Plants, який профілюється на редагуванні генів сільськогосподарських культур. Компанія DuPont проводить генетичні дослідження разом із компанією Sangamo BioSciences.

Нагадаємо, що у США технологія редагування геному перебуває поза законодавчим регулюванням ГМО, а от у Європі вже півроку судом винесено рішення про те, що CRISPR / Cas-культури визнані ГМ-методами, тому існують лише у теоретичному форматі досліджень.

Серед сільськогосподарських культур найбільше експериментів із генного інженерування проводять на сої та кукурудзі.

 

Тим часом у медицині

За допомогою CRISPR-Cas12 вийшло відредагувати ген, який містить помилку і спричиняє дистрофію Дюшена. Ці досягнення дістали дослідники південно-західного медичного центру Техаського університету. Міодистрофія Дюшена виникає через мутації в одному з найдовших людських генів, який кодує білок дистрофін, що є своєрідним амортизатором для м’язових волокон. Складність експерименту полягає в тому, що мутація може виникнути в різних частинах гена. Раніше проводили експерименти з CRISPR‑Cas9, але вони не вийшли такими вдалими через великий розмір ферменту.

«Не можу стверджувати, що час CRISPR-Cas9 уже минув, – каже автор експерименту доктор Ерік Олсон. – Є гени, які зручніше редагувати Cas9, є такі, що успішніше виправляються з допомогою Cas12. Білки різняться своїми біохімічними властивостями й розпізнають різні послідовності ДНК. Що більше ферментів ми матимемо, то більше можливостей у нас з’явиться. У будь-якому разі CRISPR-Cas12 наближує нас до генетичних причин різних захворювань.