Нанопорове секвенування в агро

Йдеться про нанопорове секвенування – технологію, схема якої була запропонована ще 1989 р., але перший промисловий зразок обладнання з’явився лише 2014-го. Китайські варіанти продукту вийшли 2024-го – отже, це й можна вважати точкою, коли починається масове поширення рішення.

Проштовхніть ДНК в отвір

Нанопорове секвенування – це третя, найсучасніша генерація методів аналізу ДНК та інших біополімерів. Полягає вона в тому, що молекулу проштовхують через нанопору, отвір у мембрані, й фіксують реакцію іонного струму, що пропускають у цей час через камеру.

Це радикально спрощує підхід, адже всі попередні технології ґрунтувалися на непрямому визначенні послідовності нуклеотидів, тобто містили стадію синтезу на ДНК-матриці. Поширена нині ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), наприклад, потребує фази ретельної підготовки проби та мічення зразка, дорогих і специфічних реагентів.

Процес проходження молекули через нанопору дещо схожий на відповідний механізм перенесення іонів у клітинних мембранах. Недарма ж у деяких рішеннях використовують природні білки, що утворюють пори. Головний елемент приладу – реакційна камера, поділена мембраною. Камера заповнена розчином електроліту. До частин камери прикладають напругу, через що виникає потік іонів через пору, адже сама мембрана не проводить струм. Коли молекули, що досліджуються, проштовхуються через пору за напрямком дії поля, вони зменшують переріз, доступний для іонів розчину, й сила струму падає. Аналізуючи профіль таких змін, можна визначити портрет молекули. В разі дослід­ження ДНК можна згрубша сказати, що струм через пору пропорційний розміру нуклеотиду, який проходить. Це дає змогу читати нуклеотидний склад безпосередньо цільової молекули.

Електричний сигнал змінює характеристики, коли ДНК проходить через нанопоровий канал

З практичного погляду це означає істотне спрощення процесу, зменшення часових затрат (насамперед, на аналіз результатів) і відчутне зниження вартості аналізу.

На практиці все, звісно, трохи складніше за ідеальну схему. Наприклад, щоб надійно розрізняти сигнал від шуму, потрібно прикладати високу напругу. Проте тоді збільшується швидкість, з якою молекула ДНК долає пору, зменшується час розпізнавання, тож якість падає вже через це. З проблемою борються, утворюючи з 1-ланцюгової ДНК 2-ланцюгові ділянки, які ще доведеться розплітати, або використовують різноманітні ферменти. Ще один спосіб – нарізання ДНК на одиничні нуклеотиди нуклеазою, котра розміщена безпосередньо біля пори.

Втім, ці деталі не нівелюють головні переваги нанопорового секвенування: високу точність і чутливість, можливість секвенування ультрадовгих фрагментів нуклеотидних послідовностей, мобільність невеличких приладів для аналізу, швидку про­цедуру та відбиття результатів у реальному часі, низьку ціну обладнання та процедури.

MinION Oxford Nanopore – найменший у світі інструмент для секвенування мікробних геномів

Очі для ухвалення рішень

Проте чи змінить нова технологія ситуацію в українському агро? Про перспективи – один із перших у нашій країні користувачів нанопорового секвенування Мирослав Парій, директор Всеукраїнського наукового інституту селекції (ВНІС):

– Нанопорове секвенування – це новий крок для сільського господарства. Ми зараз якраз перебуваємо в точці переходу від наукових дослідів до впровад­ження цих технологій у виробничі процеси.

Ми всі звикли, що визначення патогенів робиться ПЛР-аналізом. Це реакція збільшення, багаторазового копіювання певного фрагмента молекули ДНК. Вона відбувається за наявності двох праймерів, затравок, синтетичних олігонуклеотидів, що мають збігатися з певними ділянками ДНК-матриці. Якщо вони підібрані правильно відповідно до мішені (наприклад, ДНК патогену), ми нагромаджуємо певний фрагмент геному й за цією ознакою судимо про наявність чи не наявність цього патогену. Тобто нам щонайменше потрібно знати, який організм ми шукаємо.

А от прилад, що використовує нанопорове секвенування, здатен читати дуже довгі молекули ДНК. Цей метод дає змогу прочитати ДНК будь-якого зразка, визначити, які саме організми є в цьому зразку. Це може бути зразок ґрунту, стічних вод, біологічних змивів. Можна скласти повну карту того, що там живе, визначити кількісне співвідношення. Чи дає це переваги для аграрного комплексу? Безперечно. По-перше, можна виявити наявність і чисельність патогенів ще до моменту висівання чи до появи хвороби, передбачити, який профілактичний засіб потрібен агроному. По-друге, можна перевірити ефективність і склад мікробіологічних препаратів. Нарешті, можна дослідити, чи приживаються мікроорганізми з препарату в ґрунті. Бо зараз ми використовуємо такі засоби на рівні магії: вносимо та віримо. Знаючи, чи справді прижився конкретний організм в агроценозі, можна оцінити ефективність об’єктивно.

За індексом біорізноманіття ґрунтової мікробіоти можна судити про властивості ґрунту й ефективність наших заходів із менеджменту родючості. Хоча конкретних рекомендацій в останньому разі поки що немає, ще йдуть наукові дослідження, але початок обіцяє багато.

Якщо казати про ціну, то аналіз одного зразка мікробіому з урахуванням витратних реагентів коштуватиме близько $100. І це повний склад мікроорганізмів! Так, лабораторія з нуля коштуватиме близько $50 тис. плюс витрати на персонал. Вимоги до персоналу не дуже високі – рівень лаборанта, адже аналіз даних відбувається або автоматично, або його можна відсилати на аутсорс. Якщо поточна лабораторія зараз робить аналіз, наприклад, на ГМО, вона вже володіє достатньою експертністю й частиною обладнання, щоб перейти на новий метод.

Чи достатньо нам даних для технологічної роботи? Біом ґрунту у світі вже визначений доволі добре. Мікробіологів уже більше, ніж мікробів! Є відкриті, безплатні бази даних ґрунтів, іде картування регіонів і мікробіомів. Щоправда, Україна – це біла пляма на таких мапах, наші мікробіологи досі не працюють на рівні ДНК, лише на рівні морфологічних ознак мікроорганізмів.

Нанопорове секвенування також дає змогу працювати навіть із новими, ще невідомими організмами, стати інструментом дослід­ження.

Цікавий момент полягає в тому, що прилад може читати не лише ДНК, а й РНК – тобто молекули, які безпосередньо кажуть про ефективність роботи тих чи інших механізмів. Можна визначати не просто наявність мікроорганізмів, а і їхню біологічну активність. Наприклад, якщо йдеться про азотфіксацію або нітрифікацію, можна вивчити, як працюють відповідні гени. Ми можемо дослідити ферментативну активність нашого ґрунту, оперативно зрозуміти, наскільки ефективно споживаються наші добрива, як працюють операції, що були здійснені. А використання фосфору, азоту, калію – це дорого. Іноді буває, що добрива вносяться в достатній кількості, але через те, що в ґрунті немає відповідних ферментів, вони не працюють.

Уявіть, що у вас органічних добрив вистачає лише на половину полів. Знаючи мікробіологічні характеристики, ви зможете якнайефективніше розподілити їх, уносити туди, де мінімальний індекс біорізноманіття. Зростання врожайності куку­рудзи на 1 т уже компенсують витрати на аналіз 10 зразків з 1 га!

Думаю, першими споживачами технології стануть наші холдинги. Нині фітопатологи за появи ознак захворювання висувають спектр гіпотез, адже симптоми можуть бути складними. Застосування широкого спектра профілактичних препаратів про всяк випадок не лише дорого – можна, наприклад, убити корисні бактерії, але не прибрати збудника. Нанопорове секвенування дає змогу реагувати негайно й дуже точно. Прилад маленький, його навіть називають польовим секвенатором. Від моменту відбору зразка до одержання результату проходять лічені години. Це очі для ухвалення рішень. Тобто фітопатологія – це сфера номер один для застосування цієї технології.

Важливий напрям, про який варто згадати, – контроль якості зерна. Можна робити аналіз на наявність мікроорганізмів ще до того, як вони виробили критичну для вартості партії кількість мікотоксинів.

ВНІС за допомогою нанопорового секвенування працюватиме не лише з традиційними для нас трансгенними рослинами. Вже маємо від одного з холдингів запит на навчання персоналу та роботу з мікробіомом ґрунту, фітопатогенами та аналізом біопрепаратів. Наприкінці сезону буде цікаво проаналізувати результати кейсу. Як на мене, це початок нової технологічної епохи.